Los puritanos fueron mucho más influyentes que los católicos durante el reinado de Isabel. Su meta era "purificar" la Iglesia Anglicana de todo vestigio de romanismo.
Entre ellos había muchos que se habían preparado en el continente europeo, especialmente en Ginebra. Los puritanos diferían entre ellos en cuanto a la medida en que debían manifestar su lealtad al soberano. Algunos favorecían una forma presbiteriana de gobierno eclesiástico.
Tomás Cartwright se destacó entre los principales puritanos presbiterianos en los días de Isabel. John Whitgift, arzobispo de Canterbury, manipuló las cosas para que Cartwright fuera destituido de su cátedra en Cambridge. Whitgift, cabeza nominal de la Iglesia Anglicana, se puso de parte de una lealtad absoluta a la política de uniformidad de Isabel. Los separatistas o independientes eran aun más radicales que los puritanos.
Los puritanos pedían permanecer dentro de la Iglesia Anglicana, la cual anhelaban que fuera limpiada de todo rastro de catolicismo. Pero los separatistas o independientes creían, como los anabaptistas en el continente europeo, que era una necesidad la formación de iglesias separadas de la iglesia estatal.
Eran separatistas porque se apartaban de la Iglesia Anglicana, e independientes porque creían en la plena autonomía de la iglesia local. Su ideal era que cada congregación, con Cristo como su cabeza, fuera una iglesia que se gobernara a sí misma, que eligiera a su propio pastor y a otros dirigentes siguiendo lo que ellos suponían que era el modelo del Nuevo Testamento.
Su dirigente pionero principal fue Roberto Browne (c. 1550-c.1633), graduado de Cambridge, quien comenzó siendo puritano.
